芽孢染色实验

一、实验原理

芽孢又叫内生孢子（endospore）,是某些细菌长到一定阶段在菌体内形成的休眠体，具有致密的多层次外壁，壁厚，含水量极低，抗逆性强，结构复杂，在光学显微镜下表现为折光性很强的小体，通常呈圆形或椭圆形。细菌能否形成芽孢以及芽孢的形状、大小、芽孢在芽孢囊内的位置、芽孢是否膨大等特征是细菌分类、鉴定中的重要标准。 由于芽孢含水量少而脂肪含量高，芽孢壁较厚、对染料的透性差、不易着色，但一旦着色后难以脱色，所以当用石碳酸复红、结晶紫等进行芽孢染色时，菌体和芽孢囊着色，而芽孢囊的芽孢不着色或仅见很淡的颜色，游离的芽孢呈淡红色或淡蓝紫色的圆或椭圆的圈，为了芽孢着色便于观察，可以使用特殊的芽孢染色法——Schaeffer-Fulton 染色法，即用弱碱性染料孔雀绿蒸汽加热进行染色，可以看到芽孢被染成绿色。芽孢染色法的基本原理是：用着色力强的染色剂孔雀绿或石碳酸复红，在加热的条件下染色，使染料不仅进入菌体也进入芽孢内，进入菌体的染料经水洗后被脱色，而芽孢一旦着色难以被水洗脱，当用对比度大的复染剂如番红染色后，芽孢仍保留初染剂的颜色，而菌体和芽孢囊被染成复染剂的颜色，使芽孢和菌体易于区别。

二、实验试剂

5%的孔雀绿；0.5%番红水溶液；（溶液的配制先用少量乙醇溶解后，再用无菌水定溶）

三、实验仪器

酒精灯、试管架、载玻片、显微镜

四、实验操作

Schaeffer-Fulton 染色法——孔雀绿芽孢染色法

• 按常规方法将待检细菌（老龄菌，或营养琼脂上诱导芽孢产生的菌）制成涂片；
• 待涂片晾干后在酒精灯火焰上通过2-3次加热固定；
• 加5%孔雀绿水溶液于涂布处（染料以铺满涂布为度），然后用试管夹夹住放置酒精灯的外焰加热，从沸腾开始计时5-10 min，加热过程中要随时添加染色液，切勿让标本干涸。
• 待玻片冷却后，用水轻轻冲洗，直至流出的水中无染料为止；
• 待干后用番红液复染色5 min，水洗，晾干；
• 镜检：芽孢呈绿色，菌体为红色。 如图：