一、试剂与仪器
- 单糖对照品：葡萄糖(Glc)、甘露糖(Man,Sigma)、半乳糖 (Gal,Sigma)、鼠李糖(Rham)、核糖（Rib）、阿拉伯糖（Arab）、木 糖(Xyl)、岩藻糖( FUC )。
- 衍生化试剂：PMP（1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮,用甲醇溶解,浓度为:0.2 mol/L）、乙腈色谱纯（Merck）、缓冲盐 KH2PO4(浓度为 0.05 mol/L)。
- 检测仪器：Agilent1260 型高效液相色谱系统，G1322A 在线脱气机、G1311A 四元高压泵、自动进样器、紫外可变波长检测器（VWD），AT-330 柱恒温相、SVEA C18 Opal 5 μm 250*4.6 mm 色谱柱，Agilent 中文版化学工作站 C0104 版本。
二、试验步骤
- 细胞糖的水解：取300 mg 的菌体放于安瓿管中,然后加入300 μL的HCL(浓度1 mol/L),封口后放入120 ℃的烘箱水解1 h左右（水解液颜色变为棕褐色为佳）。
- 对照品标样的处理：取每种标样（梯度稀释后浓度为2 mmol/L）各10 μL 混合后，同样品一起作后续处理。
- 待冷却后，取样品和混合标样溶液各160 μL，分别置于1.5 mL 的EP管中，加入配置好的0.25 mol/L PMP 甲醇溶液160 μL,再加入0.3 mol/L 的NaOH中和至PH 7.0 (偏碱)(混合标样和样品的PH需分别调和)。
- 把EP管放70 ℃水浴锅，水浴30 min，取出冷却后，加入0.3 mol/L的HCL中和，PH调至4.0~5.0 之间（萃取效果较佳)。
- EP管中各加入乙酸乙戊脂 500 μL，涡旋（不低于2 min），弃上层，以此步骤萃取2次，溶液色素明显变淡。
- EP管中再各加入三氯甲烷 500 μL，涡旋（不低于2 min）,弃下层，以此步骤萃取2次，收集样品准备上机检测。
- 过滤后上机
三、HPLC 检测条件
1、先制备 KH2PO4 980 ml,准确调PH至 6.9，再按以下AB浓度分别加入乙腈, KH2PO4浓度为0.05 mol/L。
2、溶液A15%：乙腈（120 ml）磷酸二氢钾（680 ml）;溶液B40%:乙腈（200 ml）磷酸二氢钾（300 ml）,流动相 AB 通道分别为以上溶剂 AB。
3、进样量 20μL、温度 30 度、波长 250、流速 1ml/min，梯度脱洗：
| 时间\通道 | A(%) | B(%) | C(%) | D(%) |
| ------------ | ------------ | ------------ | ------------ | ------------ |
| 0 min | 80 | 20 | 0 | 0 |
|20 min | 70 | 30 | 0 | 0 |
|28 min | 60 | 40 | 0 | 0 |
|30 min | 80 | 20 | 0 | 0 |
四、细胞壁纯化
部分放线菌由于形态结构和特点不同，水解效果不理想的可先做细胞壁纯化。
五、
- 菌体悬浮于10%的三氯乙酸（TCA）溶液，沸水浴30 min，冷却，5000 rpm 离心10 min，蒸馏水洗3次。
- 沉淀溶于Trypsin-Phosphate 缓冲液（1 mg/mL Trypsin，0.1 mol/L PBS，pH 7.9）中，37 ℃水浴震荡淀。
- 上清液经13000 rpm 离心10 min，并蒸馏水洗3 次，得沉淀。
- 加入无水乙醇、乙醚脱水干燥，保存。
