肽聚糖提取流程

肽聚糖提取肽聚糖提取

• 取干菌体约300 mg，加1.5 mL NaCl，浸泡10 min，或湿菌体约1 g

• 加0.05 mol/L pH 7.4的PBS （0.05 mol/L NaH2PO4 19 ml 0.05 mol/L Na2HPO4 81 ml） 7 mL；

• 超声波细胞破碎仪超声40-50 min（注意：将装有样品的离心管放在冰水中；超声为开5 s，停3 s，总计40-50 min；超声功率从0→25 %后，维持在25 %） （或，46 W破壁10 min）后；(根据仪器而定)

• 收集细胞壁：5000 rpm 10 min，取上清至另一干净离心管中/EP管，此步骤注意不能取到菌体沉淀。（注意：菌体沉淀物留在该管中，冷冻保存备用）

• 12000 rpm离心20 min 弃上清，保留沉淀；

• 去蛋白：加4% SDS 1 mL溶液，室温过夜；或8% SDS 沸水浴10 min。

• 12000 rpm 室温 离心15 min，弃上清后，每管再加1.5 mL无菌超纯水,重复洗3次，洗净无泡沫。最后一次留上清1/3；

• 将剩余的上清与沉淀混匀（用枪吹打）后，移入安瓿管中，65 ℃ 烘干；（建议不用烘干）

• 每管加200 uL 6 N HCl,封口100 ℃水解20 h；

不烘干，加入高浓度的 HCL，使得安瓿管中的终浓度为6 N HCl即可。即浓盐酸的浓度为12 N,加100微升的样品加100微升的浓盐酸可得到6 N 盐酸的水解液，这样更节省时间

• 12000 rpm 离心5 min, 0.4 um 细菌过滤器过滤上清至EP管；

• 55 ℃烘干；

• 每管加600 uL 无菌超纯水溶解后55 ℃ 烘干；

• 加入300 uL无菌超纯水；

如果提取时肽聚糖提取的量较多，以上步骤也可以改为：用NaOH，调节pH 为弱酸性至中性。